1. 励起波長と蛍光波長
- 右図は、EtBr・エチジウムブロマイドを蛍光させるための励起波長（点線・Excitation Wv.）と、それによる蛍光波長（実線・Emission Wv.）の分光特性です。
- 励起のピーク波長は300nmの紫外線ですが、安全性の高い518nm前後の可視光でも、光源が充分強力なら蛍光させることが可能です。
蛍光試薬とLED光源の選び方蛍光試薬の励起・蛍光波長とフィルターワーク
目に負担の多いUV光源に代わり、可視光のLED照明装置が普及してきました。
試薬を励起する効率的な波長を選び、コントラストの高い蛍光画像を得るため、下記をご参考に、より適切な光源とフィルターをお選びください。
蛍光画像を左右する主な要素
- 使用する試薬の吸収励起波長と蛍光波長
- 照射するLED光源の波長特性
- 蛍光を分離するシャープカットフィルターの分光特性
- 蛍光と励起波長が近い場合、光源のすそ野をカットするフィルターの有無と性能
よくある障害の原因と解消方法
※ご不明な点・ご要望などがございましたら、お気軽にご相談ください。
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2. UV（紫外線）トランスイルミネーターによる蛍光励起
- 従来、EtBrの励起には254nm、312nm、365nmなどのUVトランスイルミネーターが使用されてきました。
- 短波長のUVほどエネルギーが高く、蛍光波長との差が大きいためバンドを明瞭に確認しやすい一方、検体の劣化が急激で人体への影響も見過ごせません。
※SC60は、蛍光観察に不要な光源波長をカットし、蛍光波長のみを透過させるシャープカットフィルターです。
3. 可視光LEDトランスイルミネーターによる蛍光励起
- 515nm前後の波長を持つ青色470nm、青緑（シアン）505nm、緑色530nmなどのLEDで励起可能です。
- 青色LEDでは吸収が弱く、緑色LEDは蛍光波長に近いため分離確認が困難になります。
- 右図で光源とフィルターが交差した下側はバックグラウンド光として透過します。実際の蛍光は光源よりわずかなため、この影響が非常に強くなります。
4. バックグラウンドを除去する多層膜・ダイクロイックフィルター
- 青緑LED（シアン505nm）とSC-56を使用した場合も、弱い蛍光はバックグラウンドの影響で確認しづらくなります。
- LED光源の長波長側のすそ野を急角度で遮断するロングカット・ダイクロイックフィルターLC525で、この問題を解決できます。
525nm以上を急激にカットするLC525により、バックグラウンドを排除し鮮明なバンドを確認できます。
当社の青緑色LEDトランスイルミネーターは、高性能複合ダイクロイックフィルターLC525を採用しています。
バックグラウンドを完全除去、
ダイクロイックフィルターの効果
お勧め機種 <LED505-TR60W>
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解説はあくまでもガイドラインです。光源照度や染色の程度、フィルターの性能、カメラの特性等により、結果は必ずしも一定ではなく、必ず確認できるとお約束するものではありません。実際の結果はデモ機にてご確認ください。
UVトランスイルミネーターで蛍光管がバックグラウンドになる場合
原因
デジタルカメラで撮影すると、縞状のバックグラウンドが写りコントラストが悪くなることがあります。これは、蛍光管から漏れる近赤外光と、カメラのIRカットフィルター性能が要因です。一般的なUV透過フィルターは可視光のほとんどをカットしますが、赤から近赤外は透過します。デジタルカメラの撮像素子は1200nm付近まで感度があり、IRカット性能は機種により異なります。
対処法1：IRカットフィルターを使用する
650nm以上の近赤外をカットする、明室ゲル撮影装置用の多層膜ダイクロイックフィルター「MFC65-52」を用意しています。
対処法2：赤外光を出さないフィルター付き光源を使用する
UVトランスイルミネーター「MBP-UV312」には、赤外線のほとんどをカットするハイブリッドフィルターが使用されています。
LED照明でバックグラウンドが強く、バンドが見えにくい場合
原因
LED光源は波長幅が狭く、励起光源に適していますが、ピーク波長の前後にはある程度のすそ野があります。一般的に試薬の蛍光エネルギーは光源に比べて弱いため、このすそ野がバックグラウンドとなり、蛍光そのものを見えにくくする場合があります。図の蛍光波長特性は最大値を100%とした相対値であり、実際の蛍光は光源に対してかなり低い値です。
EtBr（エチジウムブロマイド）を例に説明します。
- EtBrの場合、緑色LED（530nm）ではSC56との波長の重なりが大きく、SC60でも重なった光がバックグラウンドになります。
- 青緑LED（505nm）の場合も、SC56では光源のすそ野を十分にカットできません。
- 青色LED（470nm）はEtBrを励起する波長域での効率が低いため、十分な蛍光を得るには強力な光源が必要です。
対処法：強力な光源と適切なフィルターを使用する
LED470/505-TR60Wは60Wクラスの強力な光源です。SC60などで蛍光の短波長側をある程度カットし、長時間露光を行います。複合ダイクロイックフィルターLC525の併用でバックグラウンドを排除できます。
当社の青緑色LEDトランスイルミネーターは、高性能複合ダイクロイックフィルターLC525を採用しています。
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